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Kleine Einzeller ganz groß

von Prof. Dr. Angelika Preisfeld und Sebastian Scherdin
apreis{at}uni-wuppertal.des.scherdin{at}uni-wuppertal.de

Prof. Dr. Angelika Preisfeld
Sebastian Scherdin

Kläranlagen stellen aufgrund der Abwasserzusammensetzung aus verschiedenen Einleitern bei der Modifikation und Freisetzung von Bakterien und besonders durch die Exposition von humanpathogenen Mikroorganismen in die Oberflächengewässer ein erhebliches Gefahrenpotenzial dar. Daher sollten Maßnahmen zur Reduktion der Belastung durch pathogene Mikroorganismen auch nach Durchlaufen der letzten Klärstufe weiterhin angestrebt und beforscht werden.

Vor allem sind es die multiresistenten Bakterien, die wir aus den Medien kennen und mit Krankheiten wie z. B. Lungenentzündungen in Krankenhäusern in Verbindung bringen, die Betreiber von Kläranlagen vor eine große Herausforderung stellen. Diese potenziell humanpathogenen Mikroorganismen finden im Abwasser und besonders in Kläranlagen ideale Bedingungen für den Erwerb von Antibiotikaresistenzen vor. Daher ist es von großer Bedeutung, auch das bereits geklärte Abwasser noch von den verbliebenen Bakterien weitgehend zu befreien, bevor es in die Gewässer entlassen wird. Das filtrierende Wimpertierchen Tetrahymena pyriformis ernährt sich von Bakterien, die es dadurch wie ein „biologisches Filtersystem“ aus dem Abwasser eliminiert.

Im hier dargestellten Forschungsprojekt wird ein biotechnologisches Verfahren zur Bakterienreduktion durch Tetrahymena (Abb. 1) und seine Erprobung im halbtechnischen Maßstab vorgestellt.

Abb. 1: Das Wimpertierchen Tetrahymena. Sichtbar sind die Cilien sowie das Mundfeld (gelb), der Makronucleus und der Mikronucleus (blau) (Robinson R 2006: Ciliate Genome Sequence Reveals Unique Features of a Model Eukaryote, PLoS Biology Vol. 4/9/).

Kläranlagen stellen sogenannte „Hot-Spots“ dar, wenn es um die Entstehung von Bakterien mit Mehrfachresistenzen, sogenannte multiresistente Keime, geht. Die dort herrschenden Bedingungen, wie die extrem hohe Bakteriendichte und somit die Konkurrenz um Nährstoffe und Lebensraum, führen zu erheblichem Stress unter den Bakterien. Dadurch kann sich zum einen die Mutationsrate erhöhen, weil das Korrekturlesen der DNA geschwächt wird. Zum anderen können Bakterien untereinander genetische Informationen, wie Resistenzen gegenüber Antibiotika, übertragen. Bei gleichzeitigem Vorliegen vielfältiger Resistenzgene, die mit den unterschiedlichsten Bakterienspezies über das Abwasser in die Kläranlagen gelangt sind, sowie dem enorm hohen Selektionsdruck durch die ebenfalls mit dem Abwasser eingebrachten Antibiotika z. B. aus Krankenhäusern oder der Massentierhaltung, werden Mehrfachresistenzen bei vielen Bakterienarten begünstigt.

Die Konsequenz ist, dass die Bakterien, die mehrere Antibiotika gleichzeitig tolerieren können, einen deutlich größeren Reproduktionserfolg – auch im Abwasser – haben, da sie nicht ohne Weiteres zu eliminieren sind und somit ein großes Ausbreitungspotenzial besitzen.¹ Trotz der bereits fortgeschrittenen weiten Verbreitung der Resistenzgene im Genpool der Natur wird jede zusätzliche Verminderung des weiteren Eintrags für unbedingt notwendig erachtet, um direkte Konsequenzen auf die menschliche Gesundheit abzuschwächen. Zurzeit sterben allein in Europa und den Vereinigten Staaten von Amerika mindestens 50.000 Menschen jährlich an multiresistenten Keimen, die von den Antibiotika nicht eliminiert werden können und somit ein geschwächtes Immunsystem überfordern.²

Auf dieser Grundlage sollte die Technik der Abwasserklärung trotz einer Reduktion der Bakterien von zumeist über 99 Prozent so gestaltet werden, dass eine Exposition in die Natur und damit auch der Kontakt des Menschen mit antibiotikaresistenten Bakterien noch stärker vermieden wird. Tatsache bleibt, dass immer noch einige Millionen Bakterien pro Milliliter Abwasserablauf aus den Kläranlagen in die Gewässer gelangen.

Abb. 2: Tetrahymena nach der Nahrungsaufnahme mit gefüllten Nahrungsvakuolen.

Die Eliminationsgrundlage von Mikroorganismen dieses biotechnologischen Verfahrens basiert auf dem Einsatz des Wimpertierchens (Ciliophora) Tetrahymena pyriformis (EHRENBERG, 1830) FURGASON, das nicht pathogen ist und ubiquitär im Süßwasser vorkommt. Tetrahymena ist genetisch, zellbiologisch und molekularbiologisch ein extrem gut charakterisierter eukaryotischer Einzeller, der sich unter geeigneten Bedingungen sehr erfolgreich und schnell kultivieren lässt.³  

Tetrahymena besitzt, im Gegensatz zu den meisten Organismen, zwei durch Hüllmembranen begrenzte Zellkerne, die als Ort der genetischen Vererbung (Mikronucleus) und als Ort der zielgerichteten Genregulation (Makronucleus) dienen (Abb. 1). Ihre Erscheinung ist keulen- bzw. birnenförmig und ihr gesamter Zellkörper ist mit Wimpern überzogen, die der Fortbewegung und dem Heranstrudeln von Nahrungspartikeln dienen. Sie ernähren sich bevorzugt von Bakterien, können aber auch gelöste Nährstoffe aus einem fluiden Medium aufnehmen. Aufgenommene Bakterien werden mitsamt ihrem genetischen Material in Nahrungsvakuolen verdaut, sodass weiterer genetischer Austausch zwischen verschiedenen Bakterien unterbunden wird (Abb. 2).

Modellversuche im Labor

Die Laborversuche im Bioreaktor zeigten, dass T. pyriformis in synthetischem und realem Abwasser überleben und sich unter den in Kläranlagen herrschenden chemischen und thermischen Bedingungen erfolgreich reproduzieren kann. Im Modellversuch dezimieren sie sehr effektiv Laborstämme der drei humanpathogenen Modellbakterienarten Escherichia coli (Darmerkrankungen), Pseudomonas putida (unspezifische Infektionskrankheiten) und Bacillus subtilis (Lebensmittelvergiftungen, Darmerkrankungen), die mit ihren morphologischen Eigenschaften diejenigen typischer Abwasserbakterien repräsentieren. Bei einmaliger Bakterienzugabe über 60 Stunden zeigte sich, dass T. pyriformis die Bakterien erfolgreich reduziert, auch wenn nur noch wenige Bakterien als Nahrung vorhanden sind (Abb. 3).

Abb. 3: Verlauf der Konzentration von T. pyriformis und E. coli in Abhängigkeit von der Zeit im modellierten Laborversuch.
Abb. 4: Kontinuierlicher Zufluss von E. coli in synthetischem Abwasser.

Da es in Kläranlage aber stets schwankende Konzentrationen an Abwasser mit Bakterien gibt, haben wir überprüft, ob T. pyriformis bei einem kontinuierlichen Zufluss von Bakterien gemeinsam mit dem Abwasser weiterhin als Filtersystem effektiv sein kann. In Abbildung 4 ist zu erkennen, dass T. pyriformis die E. coli-Menge auch bei kontinuierlichem Zufluss definierter Konzentrationen von E. coli reduziert. Durch den Verdünnungseffekt des zugeführten Abwassers und die durch T. pyriformis abnehmenden Bakterienzahlen werden die Schwankungen im natürlichen System simuliert. Die Konzentration an T. pyriformis nimmt zunächst ab, pendelt sich aber nach 30 Stunden auf einem nahezu stabilen Niveau ein. In dieser Phase wird die Bakterienkonzentration trotz kontinuierlicher Zugabe niedrig gehalten. Das bedeutet, dass T. pyriformis die zugesetzten Bakterien effektiv eliminiert. 

Die praktische Umsetzung

Die Arbeiten wurden auf der Halbtechnischen Kläranlage Neuss (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen) durchgeführt. Die Versuchskläranlage wird von Rohabwasser der Kläranlage Neuss-Süd gespeist, das mechanisch vorgereinigt ist und dem Ablauf des Sand- und Fettfangs entnommen wird. Für die Versuche wurde die Versuchsstraße so gestaltet, dass nach einer vorgeschalteten Denitrifikationsstufe die konventionelle Nachklärung folgte, deren sedimentierte Rücklaufschlämme der Denitrifikation zugeführt wurden (Abb. 5).

Abb. 5: Schematische Darstellung der experimentellen Versuchsstraße.

Das Tetrahymena-Reaktionsbecken (Abb. 6) wurde über eine Schlauchpumpe aus einem Vorratstank mit Abwasser der Nachklärung gespeist und mit einem Volumen von 240 Litern betrieben. Es wurde mit T. pyriformis angeimpft, welche nach kurzer Adaptionsphase maximale Wachstumsgeschwindigkeiten erreichten. Danach konnte das Reaktionsbecken im Durchfluss betrieben werden. Der Verbleib von T. pyriformis wurde mittels Polyesterfilter mit aktiver Belüftung gewährleistet.

Zur Ermittlung der Wirksamkeit von T. pyriformis in Bezug auf die Eliminationsleistung kamen sowohl biochemische, mikrobiologische als auch molekularbiologische Verfahren zum Einsatz. Es wurde die Eliminationsleistung auf Gesamtbakterien und speziell auf die humanpathogenen coliformen Bakterien, E. coli und Enteroccocus bestimmt. Darüber hinaus wurden Legionella spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis untersucht.

Abb. 6: a) Aufbau des Reaktionsbeckens
in der Versuchsstraße.
b) das Versuchsbecken mit geklärtem Abwasser.
c) Sicht auf das Filtersystem.

In den Langzeitexperimenten zwischen 23 und 44 Tagen mit unterschiedlich starkem kontinuierlichem Durchlauf von Abwasser konnte eine deutliche Elimination aller untersuchten Bakterien im Mittel ca. um 50 % gemessen werden (Abb. 7). Die Gesamtbakterienabundanz nahm mit einem Mittelwert von 57 % ab. Bei E. coli konnten Reduktionen um 51 %, bei Gesamtcoliformen um 41 % und bei Enterococcus um 49 % erzielt werden. Auch bei niedrigerem Durchfluss von 100 L/h, welcher durch die erhöhte Verweildauer der Bakterien im Reaktionsbecken entsprechend ein größeres Volumen des Klärbeckens simuliert, wurden im Mittel Reduktionen um 50 % verzeichnet. Das System blieb auch in weiteren Versuchen über 44 Tage absolut stabil. 

Abb. 7: Relative Abnahme der Konzentrationen der potenziell humanpathogenen Bakterien E. coli, Gesamtcoliformen und Enterococcus über die Zeit.

Die hier gemessene Elimination von Bakterien liegt zwar noch unterhalb einer erstrebenswerten Log-Stufe, d. h. der Reduktion um eine Zehnerpotenz. Wenn die Bakterienkonzentrationen, wie in vielen Kläranlagen zu erwarten, aber höher liegen, wird die Eliminationsleistung von T. pyriformis aufgrund des erhöhten Nahrungsangebots entsprechend größer sein. Da die Verwendung von T. pyriformis als biologischer „Filter“ für einen Einsatz nach der üblichen Klärung gedacht ist, in der bereits mehrere Log-Stufen erfolgreiche Reduktion zu verzeichnen sind, ist die weitere Reduktion der Bakterien, besonders in Hinblick auf multiresistente Bakterien bedeutsam. Weiterhin ist der Einsatz von T. pyriformis in Kläranlagen interessant, in deren Einzugsgebiet sich ausgewiesene Badegewässer befinden. Hier könnte schon die erreichte zusätzliche Reduktion von 50 % dafür sorgen, dass die Badegewässerrichtlinie (2006) eingehalten wird.

Aufgrund immer wieder auftauchender Meldungen über Legionella spp. in Kläranlagenabläufen, haben wir ebenfalls überprüft, ob diese nachweisbar sind. Legionella spp. konnte molekularbiologisch qualitativ nachgewiesen werden, allerdings war eine Quantifizierung nicht möglich, da die Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenzen lagen. Damit lag zum Zeitpunkt der Untersuchung keine Gefährdung durch Legionella spp. vor.

Die Erkenntnisse zur Eliminationsleistung von T. pyriformis sollten zukünftig nicht nur auf den Einsatz in der Nachklärung kommunaler Kläranlagen weiterverfolgt werden, sondern darüber hinaus auch als kosteneffizientes Verfahren zur Keimreduzierung in Ländern ohne wirksame Klärsysteme Anwendung finden.

Das Projekt wurde in Kooperation mit der Universität Duisburg-Essen (Prof. Dr. Jens Boenigk, Fakultät für Biologie) im Auftrag des Landesamts für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW durchgeführt und im Rahmen der Richtlinie „Ressourceneffiziente Abwasserbeseitigung NRW“ gefördert.

www.zoologie.uni-wuppertal.de

Literaturhinweise

¹Feuerpfeil, I., López-Pila, J., Schmidt, R., Schneider, E., Szewzyk, R. (1999). Antibiotikaresistente Bakterien und Antibiotika in der Umwelt; Bundesgesundhbl. – Gesundheitsforsch. – Gesundheitsschutz 42
²Review on Antimicrobial Resistance. Antimicrobial Resistance: Tackling a Crisis for the Health and Wealth of Nations (2014)
³Tiedtke, A., Hillmann, A., Westermeier, F. (2006). Untersuchung zur Beseitigung von Bakterien im Abfluss von Kläranlagen mittels Tetrahymena